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Les nouvelles techniques de microscopie | ||
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Depuis une quinzaine d'année, l'arrivée de l'ordinateur à permis la mise au point de nouvelles méthodes d'observation, repoussant les limites de la microscopie classique au delà de ses limites actuelles. Deux d'entre elles, la microscopie confocale et la microscopie à champ proche sont en plein essort.
Une des limitation de la microscopie classique est la faible
profondeur de champ de l'image. La zone observée de mise au point
est nette, les zones immédiatement au dessus et au dessous sont
floues et perturbent l'image observée. La parade à cela consiste
à faire des préparation très fines de l'ordre du micron
en microscopie électronique, 2 à 3 µm en microscopie
optique. Mais les éléments long, tels que les fibres nerveuses,
rarement rectilignes, apparaissent fragmentées. La microscopie confocale
permet de contourner ce problème.
La microscopie confocale est basée sur la microscopie à
fluorescence (c'est donc une technique de microscopie optique), mais la
lampe à lumière blanche est remplacée par un laser,
qui fournie une lumière parfaitement cohérente. Le laser
est focalisé sur la preparation et seule la zone de focalisation
sera suffisament excitée pour emettre de la fluorescence, le reste
de la preparation, que se soit sur les cotés ou sur un autre plan
de focalisation restent sombres. En balayant par le laser tout le plan
de focalisation, on obtient une image très nette de ce plan focale,
les zones floues n'apparaissent plus.
Cette technique peut aller encore plus loin. Entre chaque balayage, le plan focal peut être modifié pour traiter toute l'épaisseur de la preparation. On dispose alors de la luminosité de tous les points de la préparation qui peuvent être utilisé de plusieurs façon :
Le microscope confocal est construit sur un microscope à fluorescence standard qui fournit l'optique auquel se rajoute un sysème spécial de traitement du rayon laser. Après émission, le rayon laser (contenant seulement deux à trois fréquences) est renvoyé sur la préparation par deux miroirs actionnés par des moteurs piezoéléectriques. Ces miroirs, en vibrant de manière parfaitement contrôlée assurent le balayage de la préparation. La lumière laser déjà cohérentes est focalisée par l'objectif, seul le pixel se trouvant au point de focalisation sera suffisament excité pour émettre de la lumière. La lumière émise par la préparation repart par le même chemin, mais un miroir dichroique l'empêche de remonter jusqu'à la source laser et la dévie vers le système optique spécial. Celui-ci contient une série de miroirs qui replient le rayon plusieurs (pour économiser la place), puis un second miroir dichroique sépare les différentes fréquences du rayon émis (ce qui permet de réaliser deux marquages simultanément. Les rayons sont captés par deux photorécepteurs qui detectent l'intensité lumineuse de l'émission. Le résultat des photorecepteurs est envoyé à un ordinateur qui assure le traitement de l'image. Juste avant chaque photorecepteur un trou extremement fin, le pin-hole (trou d'aiguille en anglais) diaphragme le rayon éliminer les rayons qui sont légèrement hors de l'axe. Ce trou diminue la luminosité de l'image (ce que l'ordinateur peut compenser) mais en revanche, il augmente fortement la résolution du système en éliminant la lumière des points de la préparation situés à proximité immédiate du point focal. Grace à ça, le microscope confocal s'approche de la limite théorique de résolution d'un système optique plus près que n'importe quel autre microscope.
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La tomographie numérique permet de reprendre les idées
du confocal, à un niveau de qualité moindre, mais applicable
également en lumière directe, alors que le confocal ne marche
qu'en fluorescence. La technique consiste à acquérir en microscopie
optique des images à différents plans focaux de la préparation
observée. Ces images comportent aussi bien les zones nettes
que les zones floues. Une traitement informatique par deconvolution va
permettre, en comparant plusieurs plans focaux successifs, d'éliminer
les zone flous pour ne conserver que les zones nettes. Au final, on obtient
une série de plan focaux, similaires à ceux obtenus en microscopie
confocale et pouvant être utilisée de la même manière.
Cette technique marche sur des images obtenues par toute techniques
de microscopie optique, y compris confocale. Dans ce cas, l'image obtenue
est d'une netteté extraordinaire.
C'est la variante appliquée à l'optique de la microscopie à effet tunnel et si cette dernière n'a aucune application en biologie, ce n'est pas me cas de la microscopie optique à champ proche qui est promise à un bel avenir. Les photons qui eclairent la préparation transportent l'information sous deux formes, une forme radiative, exploitée en microscopie optique traditionnelle et obeissant à la loi de Raleight et une forme non radiative (qui ne se propage donc pas) donc non captée par les optiques standard, n'obéissant pas à cette loi. La microscopie à champ proche capte ces photons non radiatifs par effet tunnel, ce qui permet d'obtenir une image d'une résolution très élevée.
Laurent DELEPINE Dernière mise à jour le 03 dec 2000
La photographie suivante montre un exemple d'image obtenue avec un microscope confocal. Ces fibres nerveuses sympathiques sont révélées
par un anticorps anti tyrosine hydroxylase marqué au FITC. L'image est la reconstitution par addition de 20 plans images espacés de 0,6 µm.
On peut constater par rapport aux images en fluorescence standard la nettetée supérieure et qui se conserve pour toute la préparation
malgré la forte épaisseur (12µm) ce qui permet d'avoir des fibres continues.