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La microscopie optique | ||
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Cette technique est la plus ancienne utilisée. Elle est également celle dont il existe le plus de variantes. Le principe est le suivant, la préparation est eclairée par une lampe. Les molécules à observer vont intéragir avec la lumière de plusieurs façons :
C'est le cas le plus simple. Les structures à observer
sont colorées, soit qu'elles le soient naturellement, soit que ce
soit le résultat d'un marquage. La lumière blanche émise
par une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse.
Selon l'intensité de la coloration, la lumière sera plus
ou moins absorbée et l'endroit apparaitra plus ou moins sombre,
les zones peu marquée restant relativement claires. La coloration
est due soit à un colorant qui se fixe de façon préférentielle
à une molécule particulière ou une famille de molécules,
soit à un précipité sombre. Ce précipité
est du à l'action d'une enzyme et se produit à l'endroit
ou celle ci se trouve, ce qui permet d'observer la répartition de
l'enzyme dans la structure biologique.
Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni coloration dans leur milieu d'origine. C'est donc l'une des rares qui permet d'observer des cellules vivantes. Elle est ainsi très utilisée en ingénierie cellulaire. Le principe est basé sur le fait que les structures biologiques sont transparentes, mais qu'elles ont un indice de refraction différent. Les rayons lumineux vont donc subir des déviations en passant d'un milieu à un autre, cela se traduit par un déphasage entre les rayons. En supprimant les rayons lumineux en fonction de leur déphasage, on obtient une image en niveau de gris qui visualise tous les changements de milieu à l'intérieur de l'objet observé. En pratique, on supprime ces rayons déphasés en plaçant des diaphragmes qui bloquent la lumière dans l'axe de l'objectif, mais laissent passer ceux de la périphérie.
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Cette variante exploite la capacité qu'ont certaines molécules d'émettre de la lumière quand on les eclaire avec une
lumière de longueur d'onde supérieure. Dans son principe, la lumière émise par une source de lumière blanche est
filtrée pour isoler la longueur d'onde qui va exciter la préparation puis focalisée sur la zone d'observation par l'objectif.
La lumière émise est captée par l'objectif, filtré pour isoler les longueurs d'ondes parasites qui pourraient brouiller
le signal (comme la longueur d'onde d'excitation par exemple) puis observée.
L'image obtenue est inverse de celle obtenue en lumière directe, les objets observés se detachent en lumineux sur le
fond sombre, le constraste final étant alors beaucoup plus élevé, comme on peut le voir ici.
Il est possible d'utiliser plusieurs marquages simultanément qui seront excité et émettront avec des longueur d'ondes
différentes. On obtient alors un marquage bicolore comme ce double marquage FITC/TRITC. Au marquage précédent en vert, on a
rajouté un marquage des macrophages par un anticorps spécifique de ces cellules porteur du fluorophore TRITC qui produit
une lumière rouge quand il eclairé avec une lumiere verte. On constate que si les deux marquages se produisent au même endroit
ils ne s'effectuent pas sur les mêmes cellules. Les cellules qui absorbent la BSA extravasée (qui sort des vaisseaux sanguins) ne sont
donc pas des macrophages/monocytes. D'autres marquages seront nécessaires pour déterminer leur type exact.
Cliché Laurent Delépine.