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L'immunomarquage

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Les techniques d'immunomarquage, mettant en corps les anticorps, sont parmi les plus performantes. Leur succés viens à la fois de leur facilité de mise en oeuvre, du nombres de molécules différentes que peuvent reconnaitre les anticorps et du fait que les mêmes anticorps peuvent servir aussi bien à marquer des cellules en vue d'une observation microscopique qu'à des dosages extrèmement précis. Quand on arrive à trouver un anticorps qui reconnait une molécule, le test est quasiment derrière. Ces possibilités et le fait qu'il est possible de produire quasiment n'importe quel anticorps à partir du moment ou l'on dispose de la molécule à reconnaitre ont fait qu'aujourd'hui, la plupart des tests diagnostics, dont celui du VIH dans le sang, sont basés sur les anticorps.

Il existe plusieurs techniques d'immunomarquage. L'immunohistofluorescence et l'immunihistochimie correspondent à l'immunomarquage des tissus biologiques, le premier utilisant un fluorophore comme marqueur alors pour le second c'est une enzyme. L'immunocytofluorescence et (beacoup plus rarement) l'immunocytochimie correspondent au marquage de cellules ou d'organites cellulaires. Il exite aussi toutes les variantes utilisant la radioactivité et les métaux lourds pour le microscope électronique.



Les anticorps

Les anticorps sont des molécules complexes, appartenant à la famille des immunoglobulines (ce qui explique que l'abréviation courante d'anticorps soit Ig) communes à tous les vertébrés, elle même membre de la superfamille des immunoglobulines, qui comprend outre les immunoglobulines d'autres protéines apparentées qui possèdent souvent une fonction de reconnaissance. Ils sont fabriqué par les plasmocytes, des lymphocytes B activés. Les anticorps ont une seule fonction : reconnaitre et se fixer de façon spécifique à une molécule nommée antigène. Les anticorps possédant deux sites de fixation pour cette molécule et chaque molécule possédant plusieurs zones de reconnaissance par les anticorps, cela entraine une agglomération de la molécule et une précipitation qui l'inactive. Par ailleurs, les molécules marquées sont reconnues par les cellules immunitaires et detruites. Quand la molécule est portée par une bactérie, celle ci est tuée.

Représentation schématique d'un anticorpsLes anticorps sont formés de deux chaines lourdes et de deux légères assemblées pour former un Y. Ces chaines sont réunies par des ponts disulfures très flexibles, par ailleurs la chaine lourde est elle même articulée, l'ensemble est donc, malgré sa taille élevée, très deformable, ce qui est indispensable pour relier deux molécules qui n'ont pas forcement le bon gout d'être localisées à la bonne distance. Chaque chaine est constituée d'une zone constante commune à tout les anticorps d'une même famille, et d'une zone variable, spécifique de chaque anticorps et qui reconnait la molécule.

Chaque anticorps reconnait une zone précise sur son antigène nommé épitope. Un antigènes peut comporter plusieurs épitopes reconnus par des anticorps différents. En biologie, on utilise généralement des anticorps polyclonaux, c'est à dire des anticorps synthétisés par de clones différents de lympohcytes B, donc différents. Il existe aussi des anticorps monoclonaux, tous les anticorps sont fabriqué par le même clone de lymphocytes B et sont tous identiques, ils reconnaissent donc tous le même épitope.


Principe de l'immunomarquage

Le principe de l'immunomarquageLe principe est extrèmement simple : la préparation qui comporte la molécule à mettre en évidence est plongée dans une solution contenant l'anticorps dit primaire. Celui ci se fixe de façon spécifique à l'antigène. Après rincage, l'excés d'anticorps est évacué, il ne reste que celui qui s'est fixé. Cet anticorps pourrait être directement porteur du marqueur (fluorophore ou enzyme), toutefois, les biologistes ont choisi une deuxième solution : les anticorps produits par un animal sont eux même des antigènes pour un autre animal. Cet anticorps primaire va être à sont tour reconnu par un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de l'animal qui a servi à produire l'anticorps primaire et qui va réellement porter le marqueur. Ils y a plusieurs avantages à l'utilisation d'une telle technique indirecte :



L'obtention des anticorps

A l'heure actuelle, seuls les lymphocytes de vertébrés sont capables de produire des anticorps. Toutefois, au repos, l'animal produit peu d'anticorps. Pour qu'il produise les anticorps dirigés contre une molécule, il est nécessaire de la lui présenter. La première étape consiste donc à purifier cette molécule. Tant que cette première étape n'est pas achevée, il n'y a pas d'obtention d'anticorps possibles.


Les anticorps polyclonaux

Les anticorps polyclonaux portent ce nom car ils sont produits par plusieurs clones de lymphocytes B. Les lymphocytes B ne sont capables de synthétiser qu'un seul anticorps. Le choix de cet anticorps est determiné par des rearrangements chromosomiques effectués au hasard pendant l'hematopoiese. Chaque lymphocyte est donc virtuellement unique aux cellules résultant de sa propre division prés. Quand un lymphocyte B reconnait l'antigène qui correspond à son anticorps, il va se diviser et les cellules filles vont se differencier en plasmocytes qui vont synthétiser l'anticorps. Les cellules filles résultant de la division d'un seul lymphocyte B sont appelées des clones.

L'antigène à reconnaitre est injecté à l'animal. Il porte plusieurs épitopes, plusieurs lymphocytes B vont donc le reconnaitre et se diviser. Après quelques semaines, une prise de sang va permettre récuperer le sérum contenant les anticorps synthétisés. Ils sont donc la production de plusieurs clones différents, d'où le nom de polyclonal.

La technique polyclonale présente un certain nombre d'inconvenient : le sérum contient des anticorps dirigés contre la protéine à reconnaitre, mais aussi d'autres qui peuvent entrainer un parasitage du marquage. Par ailleurs, le type exact des anticorps produit par un lymphocyte est le fruit du hasard. D'un animal à l'autre les anticorps résultant par un même protocole d'immunisation peuvent être différents et les résultats être partiellement non reproductibles. Il n'est pas rare que la mort de l'animal entraine la disparation d'un anticorps polyclonal très efficace dont aucun équivalent ne pourra être retrouvé plus tard. C'est pour ça que des animaux à durée de vie longue (cheval, chevre, porc) sont courament utilisés à coté des animaux plus traditionnels tels que le rat et la souris. De plus, la production du sérum par un seul animal limite sa diffusion. Enfin, la nécessité de prendre le sérum directement sur l'animal oblige à choisir des animaux de grande taille pour avoir une production suffisante. En revanche les anticorps polyclonaux ont extrement sensibles en raison du nombre important d'épitope reconnu sur un seul antigène.


Les anticorps monoclonaux

Ils résolvent les inconvénients des anticorps polyclonaux. Ils sont en effet fabriqué par un seul clone de lymphocyte B donc ils sont tous identiques et reconnaissant un seul épitope. Ils gagnent donc en précision ce qu'ils perdent en sensibilité. Ils sont en plus fabriqués par des cultures cellulaires, leur durée de production dépasse donc la vie de l'animal, elle est quasiment eternelle. De plus, des petits animaux peuvent être utilisés tels que les souris pour donner naissance aux lymphocytes, ce qui permet de tester un grand nombre d'anticorps pour trouver le bon.

La première étape est la production d'un sérum polyclonal par la methode précédente. Les sérum sont testé pour trouver celui qui reconnaitra le mieux la molécule. Quand on a ce sérum, on recupère les plasmocytes, certains sont présent dans le sérum avec les cellules sanguines, et on les mets en culture dans des plaques à trou. Chaque puit de la plaque contient un nombre réduit de clone et donc un sous ensemble des anticorps du sérum total. La production de chaque puit est testé pour trouver celui qui produit le bon anticorps. A ce stade, les cellules sont normale, cela signifie qu'après quelques divisions les cellules vont viellir et mourir. Il est nécessaire de les immortaliser pour obtenir une culture continue. On y arrive en les fusionnant avec des cellules de lymphome, donc déjà immortelles. On obtient des hybridomes qui vont avoir à la fois être l'immortelles et produire des anticorps. Les cellules inetressantes sont remisent en culture dans une plaque à puit à une dilution moyenne d'une seule cellule par puit. Le puit produisant le bon anticorps est recherché et a nouveau diluée de la même façon. A ce stade, chaque puit ne contient qu'un seul clone de cellule. Celui qui produit l'anticorps désiré peut alors être mis en culture en volumes plus important. Il synthétisera eternellement l'anticorps.

On peut noter que la molécule antigènique peut être mal purifiée. La phase de criblage des hybridomes va permettre d'isoler progressivement un clone producteur d'un anticorps spécifique de la molécule même si au départ le sérum reconnait plusieurs protéines. L'anticorps produit va permettre en retour de purifier la protéine.

Les anticorps monoclonaux sont à la fois une réussite technique et un ratage financier l'un des plus beau de l'histoire de la biologie. Le biologiste qui les a développé l'a fait car il en avait besoin, mais il n'avait jamais imaginé que cela pouvait avoir un interêt en dehors de son domaine. Il n'a donc pas déposé de brevet qui ici aurait été parfaitement justifié (puisque concernant une technique) alors que tant d'entre eux sont déposés sur des sujets douteux. Aujourd'hui la fabrication des anticorps monoclonaux est une des entreprises de biotechnologie les plus rentable, d'un chiffre d'affaire de plusieurs centaine de milliards de dollards : la quasi totalité des tests biologiques comme la detection du VIH ou du virus de l'hépatite utilisent des anticorps monoclonaux. Le biologiste a été négligent, cela lui a couté plusieurs centaines de millions de revenus. Et pour une fois, ce n'est pas un Français, pourtant coutumier du genre, qui a fait l'erreur, mais un américain.



Laurent DELEPINE
Création le 06 dec 2001.
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