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La mise en évidence | ||
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Toutes les techniques de detection des molécules biologiques sont basées sur le même principe : le biologiste dispose d'une molécule ou d'un système moléculaire qui à la propriété de se fixer de façon plus ou moins spécifique à ce qu'il veut détecter. Cet echafaudage de molécule est normalement invisible. Mais celui ci étant construit par le biologiste ou un laboratoire spécialisé, on peux lui fixer un marqueur, c'est à dire une molécule ou un atome qui va la rendre visible au matériel dont dispose le manipulateur, que celui ci soit un microscope, un scintillateur ou encore un colorimetre.
Les marqueurs sont très variés, ce qui permet d'appliquer tous les types de mise en évidence : molécule colorée ou fluorescente, atome radioactif, metal lourd, enzyme.
Le piège courant est de confondre ces marqueurs avec le marquage qui est la fixation des molécules spécifiques aux molécules à detecter et avec les "marqueurs biologiques" qui sont des molécules spécifiques d'un objet biologique particulier : lignée cellulaire, organite. La molécule CD4 est par exemple spécifique d'un sous type de lymphocyte, eux seuls possèdent cette molécule et ils la possèdent tous, le CD4 est donc un marqueur biologique de ce sous type cellulaire. La détection d'un marqueur biologique signifie donc que l'on est en présence d'un objet parfaitement determiné. Les marqueurs dont il est question dans ce chapitre sont une notion différente.
Ici à la molécule de détection est accrochée une molécule fluorescente ou fluorophore. Il existe plusieurs types de flurophores qui se distinguent par leur longueur d'onde d'excitation et d'émission, ce qui permet d'en combiner plusieurs sur une même préparation. La fluorescence peut être utilisée pour effectuer des dosages en utilisant un spectrophotometre, mais son utilisation principale est la microscopie à fluorescence. Le principal avantage de la flurorescence est sa sensibilité et sa facilité de mise en oeuvre.
Le marqueur de la molécule de détection est ici un atome
radioactif. Dans la plupart des cas, il s'agit d'un atome d'iode qui
est substitué à un atome de chlore. Cette réaction
est assez facile à mettre en oeuvre de façon spécifique
mais la taille élevée de l'iode peut parfois modifier la
géométrie de la molécule et diminuer son affinité
pour sa cible. D'autres atomes sont cependant accessibles : carbone, phosphore,
hydrogène. La radiation d'un atome se caractérise par le
type de particule émise (beta ou gamma) et par l'énergie
de l'émission. Les compteurs geigers ne sont pas sensible à
l'énergie mais ils ne sont plus utilisés, les scintillateurs
modernes sont beaucoup plus performants, on peux utiliser plusieurs atomes radioactifs sur
la même préparation et les différencier. Dans un scintillateur,
la préparation est plongée dans un liquide sensible à
la radiation : le scintillant. Lorsque une désintegration a lieu,
les particules sont absorbées par le scintillant qui emet un photon
detectée par le scintillateur. Cette technique ne permet que des
dosages.
Une autre méthode de détection est de poser la préparation
sur une pellicule photographique qui sera developpée au bout d'un
certain temps d'exposition, de quelques heures à quelques jours.
On obtient alors une image dont les zones sombres sont les plus radioactives.
L'autoradiographie permet de travailler sur des préparations de
taille importantes, comme des tranches de cerveau (dm²), contrairement
à la fluorescence qui actuellement n'existe que pour les microscopes
et est donc limitée à des petites surfaces inférieures
au millimétre carré.
Le principal inconvénient de la radioactivité est son
danger, les risques de contamination sont d'autant plus grave que les atomes
sont intégrés dans des molécules biologiques et
peuvent être assimilés par l'organisme s'ils sont
ingérés. Cela oblige à prendre des précautions
considérables lors des manipulations. En revanche ce marquage est
le plus sensible qui existe actuellement, 10 fois plus que pour la fluorescence.
Toutes les techniques de repérage peuvent être utilisée pour le microscope électronique, mais pour arrêter les électrons et obtenir une image il est nécessaire d'utiliser des matériaux denses, ce qui n'est pas le cas des molécules biologiques. Les biologistes ont donc greffé des métaux lourds aux molécules sensibles : or, platine, etc... La signature de ces métaux est différente au microscope électronique on peut donc en utiliser plusieur pour obtenir un marquage complexe.
Dans les techniques précédentes, les molécules
sensibles étaient d'origine biologique et les marqueurs detectés
par leurs propriétés physiques. Ici c'est l'activité
biologique du marqueur qui est mise en évidence. En effet, ce marqueur
est une enzyme et donc doué d'activité catalytique. La plupart
des enzymes sont spécifiques d'une seule réaction dans la
cellule, mais il existe des molécules articificielles qui peuvent
être métabolisées par certaines enzymes, la spécificité
n'est pas absolue. En choisissant un produit de réaction coloré,
l'enzyme est mise en évidence par une tache sombre à l'endroit
ou elle s'est fixée. L'enzyme la plus courament utilisée
est la péroxydase du raifort qui transforme l'eau oxygénée
en eau et en oxygène. L'oxygène dégagé va
réagir avec une molécule qui devient noire et insoluble sous
sa forme oxydée. De nombreuses autres enzymes sont utilisées.
Cette technique est assez sensible, si le marquage est insuffisant il suffit
de prolonger la réaction enzymatique pour l'augmenter. D'autre part
elle peut être utlisée sous microscope pour donner une image
ou, la vitesse de réaction d'une enzyme étant une caractéristique
parfaitement définie, pour des dosages (le produit de réaction
est alors soluble et coloré).
Le principal avantage est sont universalité (visualisation et dosage) et sa
facilité de mise en oeuvre. Elle est toutefois perturbée par les enzymes
existants à l'état naturel dans une cellule, celles ci peuvent
aussi réagir avec le substrat et donner une coloration parasite
si la phase de désactivation des enzymes endogène est insuffisante.
Ceci peux être cependant un avantage : si le biologiste veux détecter
une enzyme endogène et qu'elle catalyse une réaction colorée,
il suffit de lui fournir les substrats nécessaires sans passer par
des techniques qui peuvent être complexes utilisant les anticorps
ou des ligands plus divers. La molécule est alors son propre marqueur.
