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La centrifugation | ||
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Tout corps plongé dans un liquide subit l'action de deux forces : son poids, dirigé vers le bas, et la poussée d'archimède dirigée vers le haut. Selon sa densité, supérieure ou inférieure à celle du milieu, la force résultante sera dirigée vers le bas ou vers le haut, le corps descendra ou remontera dans le liquide. Ce phénomène est la sédimentation. Les macromolécules biologiques n'echappent pas à cette regle. Un exemple simple est fourni par les globules rouges qui tombent au fond du tube quand on laisse reposer un prélèvement de sang, les globules blancs moins denses formant une fine couche juste au dessus. En attendant assez longtemps, les molécules se repartiront en trois groupes, celle qui sont descendues au fond, celles qui sont remontées à la surface et celles qui sont encore en solution. En modulant correctement la densité du milieu on peut donc purifier une molécule.
Ce phénomène est long, il prend près d'une heure dans le cas du sang, et pourtant il s'agit de cellules, donc de quelque chose d'assez gros. La plupart des molécules biologiques sont beaucoup plus petites et la sédimentation naturelle prend plus de temps : plusieurs semaines, plusieurs années voire plusieurs sciecles. Surtout dans le dernier cas, un biologiste ne peut pas attendre aussi longtemps.
Si l'accélération de la pesanteur était plus élevée, mettont 100 G les choses seraient différentes : les deux forces seraient plus intenses, leur résultante le serait aussi, la molécule sédimenterait aussi plus vite, à 100 G ce serait 100 fois plus vite qu'à 1. A 1000 ou 10000 G ça irait encore plus vite. Toutefois, on ne sait pas agir sur l'accélération de la pesanteur. Sur terre, on reste desespérement à 1 G. Il faut utiliser une autre accélération.
Tout le monde a un jour fait tourner un mobile fixé à une ficelle et a pu se rendre compte qu'à partir d'une certaine vitesse la force dominante n'est plus celle de la pesanteur, mais la force centrifuge. C'est cette force qui est exploitée en biologie. Un appareil spécial appelé centrifugeuse entraine les préparation biologiques à des vitesse de plusieurs dizaines à plusieurs centaines de milliers de tours par seconde, produisant des accélerations de plus milliers de G sur la molécule à purifier. La sédimentation se produit alors en quelques heures au lieu de plusieurs années. De part ses variations, la centrifugation est une technique de purification très puissante. Aujourd'hui les petites centrifugeuses (ou centrifugeuses de paillasses) sont aussi courantes dans les laboratoires que les réfrigérateurs dans une maison. Les plus grosses et les plus rapides, appellées ultracentrifugeuses, font parties du matériel lourd et sont achetées et exploitées en communs par plusieurs laboratoire.
Une centrifugeuse est constitué d'un axe portant un rotor spécial, l'ensemble étant entrainé par un moteur puissant. Le rotor porte des emplacements, situés symétriquement de part et d'autre de l'axe, qui peuvent recevoir des tubes contenant les préparations biologiques. L'ensemble est enfermé dans une cuve, scellée pendant la rotation, pour des raisons de sécurités.
Deux problèmes se posent dans l'utilisation d'une centrifugeuse,
surtout pour les ultracentrifugeuses : le deséquilibre du rotor
et le dégagement de chaleur.
Le premier d'entre eux, le désequilibre est la bête noire
des biologiste. Un désequilibre de g de part et d'autre du rotor
se traduit par un équivalent de 100 kg sur l'axe à 100000
G. Un telle contrainte aboutit a la rupture de l'axe et le rotor s'envole
tel un fresbee. A une telle vitesse, le rotor n' est pas particulièrement
géné par le mur de béton de la pièce, encore
moins par le technicien se trouve sur son trajet. Tous les vieux biologistes
ont un jour entendu parler d'accidents de ce genres qui se sont terminé
en drames. Aujourd'hui le problème est moins critique car les matériaux
sont de meilleures qualité qu'autrefois et les systèmes de
sécurité empêchent la centrifugeuse d'accélerer
si un déséquilibre est détecté. Mais la meilleure
protection est quand même de préparer ses tubes avec soin.
Les balances modernes permettent d'ajuster le poids d'un tube au mg près,
ce qui assure une marge de sécurité suffisante.
Le second problème est plus génant. A la vitesse des
centrifugeuses, le frottement de l'air sur le rotor produit de fortes quantités
de chaleur. Or les molécules biologiques sont sensobles à
la chaleur. Une première approche consiste a refrigérér
le rotor, toutes les centrifugeuses sont équipées de ce système.
Mais à 50000 ou 100000 tours par minutes ça ne suffit plus.
La solution consiste donc à supprimer les frottements en faisant
tourner le rotor dans le vide. Les ultracentrifugeuses sont donc équipées
de pompes à vides extrèmement performantes parmi les meilleures
que l'homme sache produire.
Un des attraits de la centrifugation est qu'il s'agit d'une des rare
techniques utilisable sur de grosses quantités de matériel.
Elle peut ainsi être utilisée au niveau industriel. L'exemple
le plus connu est la stérilisation du lait : une centrifugation
modérée sédimente les bactéries, les substances
du lait plus légères ne sont que peu touchées.
Au début de la centrifugation, le mélange contenant la substance a isoler est déposée à la surface du liquide. Au cours de la centrifugation, la molécule descend en fonction de sa densité. La vitesse de sédimentation est exprimée dans une unité indépendante des densitées du milieu et de l'accélération : le Svedberg (S). Plus la valeur en Svedberg est élevée, plus elle arrivera vite au fond du tube. A la fin de la centrifugation, le tube contient deux phases distinctes : un dépot plus ou moins solide au fond du tube qui correspond au molécules ayant reussi à sédimenter jusqu'au bout et appelé culot, un phase liquide qui contient toute les molécules n'ayant pas atteind le fond du tube, le surnageant. Selon les cas, la molécules désirée est dans le culot, le surnageant ou repartie entre les deux (dans ce dernier cas, cela signifie que les paramêtres de centrifugation ont été mal choisis).
A partir de cette base simple, les biologistes ont développée plusieurs variantes de la centrifugation. La molécule à purifier n'est pas forcément la plus dense ou la moins dense. On peut aussi vouloir obtenir un profil de sédimentation, c'est à dire étudier la concentration en molécule en fonction du coefficient de sédimentation. Les biologistes ont donc réussis à imaginer et à fabriquer des milieux de densités variables en fonction de la profondeur dans le tube.
Dans ce genre de centrifugation, le milieu est consisté de deux solution de densités différentes. La partie inférieure du tube contient un milieu a densité élevée, la partie supérieure contient un milieu de plus faible densité. En fin de centrifugatin, les molécules sont réparties en trois points : les molécules légères à la surface, les plus lourdes au fond, et à l'interface entre les deux milieux les molécules plus denses que le premier milieu mais moins denses que le second. En choisissant bien la densité des liquides, la molécule purifier se retrouve à l'interface et est isolée de la plupart des molécules plus denses et moins denses. Cette technique est donc plus performante que la centrifugation avec un milieu de densité unique, mais il faut avoir une idée du coefficient de sédimentation de la molécule à purifier pour que la fourchette entre les deux densité soit le plus proche afin d'éliminer un maximum des autres molécules.
On peut signaler que l'on est pas obligé de se limiter à seulement deux densité, mais qu'on en peut avoir plus. La condition étant que les milieux légers soient au dessus des milieu denses. Pour des raisons techniques il est difficile d'aller au dela de 4. Par ailleurs, la position des molécules dépend peu des conditions de centrifugation, il suffit que celles ci soient suffisament énergique pour que le phénomène se produise jusqu'au bout (mais sans aller jusqu'à detruire la molécule).
Ici la densité du milieu varie de façon continue
depuis un maximum au fond du tube à une minimum à la surface.
A la fin de la centrifugation, les molécules seront réparties
dans le tube en fonction de leur densité. Cela peut sembler être
une extrapolation de la technique précédente, mais en réalité
sa finalité est très différente. Elle ne sert pas
à purifier une molécule que l'on veut étudier mais
a créer un profil de densité des molécules d'une
solution.
Un exemple est la répartition des différentes variantes de la cholinestérase au niveau de la plaque motrice. Toutes ces molécules ont le même substrat (l'acétylcholine) et sont detectées et dosées par la même technique. Le dosage par les moyens traditionnels ne donne qu'une activité globale sans aucune indication de leur répartition. La centrifugation en gradient de densité permet de les séparer. Le contenu du tube est ensuite reparti par un collecteur de fraction dans plusieurs tubes qui ne contiennent qu'une seule forme de la molécule, puis la molécule est dosée dans chaque tube. Le coefficient de sédimentation de chaque molécule et donc le tube ou elle doit se trouver, étant connu, on peut tracer un profil de densité comme indiqué sur la figure ci contre. Ce profil représente la quantité de la molécule en fonction de la fraction (donc de la densité). Chaque enzyme, représentée par un pic, peut être ainsi mesurée séparément et on peut obtenir la proportion de chacune dans la totalité.
