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La chromatographie | ||
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La chromatographie est comme la centrifugation une technique au principe
extrémement simple mais que la technique a perfectionné au
point d'en faire une technique de séparation extréement puissante.
Couplé à des detecteurs performants elles est la technique
la plus sensible existant actuellement pour doser une substance dans un
mélange. Les chromatographes sont donc l'outils de choix de detections
des polluants dans les laboratoires d'analyse.
Pourtant, n'importe qui peut faire une chromatographie chez soi avec
le matériel dont il dispose et tout le monde en à fait sans
le savoir. Faites une tache d'encre sur une feuille de papier avec un stylo,
laisser tomber une goutte d'eau, les constituants de l'encre vont diffuser,
formant des cercles concentriques autour de la tache initiale. Au bout
de quelques minutes, ces constituants seront tous séparés,
chacun dans leur cercle concentrique. Les premières chromatographie
imaginée il y a un sciècle sont à peine plus compliquée
et pourtant toujours utilisé.
Dans une chromatographie, la substance dont on veut isoler les constituants est entrainée par un fluide en circulation. Ce fluide circule dans un milieu poreux qui va ralentir les composants de la substance. Selon les interactions existant entre chaque constituant et d'une part le fluide, d'autre part le milieu poreux celui ci sera entrainé plus ou moins vite. Les constituants de la substance vont ainsi se trouver séparés des autres. Pour la detection des différents constituants, ils y a deux possibilités : soit ils seront répartis sur l'ensemble du milieu (par exemple une feuille de papier) et seront révélés tous en même temps par une methode de coloration spécifique de la famille de la subtance recherché, soit ils passeront l'un après l'autre (en fonction du retard pris dans le milieu poreux) devant un detecteur spécial qui se base sur les propriété physiques des molécules étudiées. Dans l'exemple ci dessus le milieu est la feuille de papier, le fluide est l'eau et la subtance l'encre.
Trois techniques de chromatographie existenté :
Cette technique est la plus simple. Des bandes de papier sont maintenues verticales, la base plongeant dans un solvant, en général de l'eau. La subtance à séparer est déposée à la base de la bande de papier juste au dessus de la surface du liquide. Le liquide va monter le long de la bande de papier par capillarité, il va entrainer la substance avec elle, chaque substance à une vitesse différente. Un traceur, molécule colorée très soluble dans le solvant, va migrer presque à la même vitesse que lui et permettre de surveiller le front de progression. Quand la progression est terminée la bande de papier va pouvoir être traitée en globalité par des révélateurs spécifiques. Les molécules detectées vont apparaitre sous forme de taches colorées (les spots) réparties entre le point de départ et le front de migration du traceur. Pour une molécule donnée, pour un même papier et un même solvant, le rapport distance de migration / front de migration du traceur est constante, ce qui permet d'identifer une substance et de savoir si elle référencée ou pas. Après photographie pour conservation du resultat, la bande peut être découpée pour récuper les spots et solubiliser la molécule qu'ils contiennent pour analyse ou dosage.
Cette technique marche en théorie avec n'importe quel papier, mais pour assurer la reproductibilité des résulats, les fournisseurs fabirquent aujourd'hui des papiers spéciaux aux pores parfaitement calibrés, voire des matériaux qui n'ont plus rien à voir avec le papier.
Dans cette forme de chromatographie, la subtance poreuse est formée de petites bille contenue dans une colonne, le liquide entre par une extrémité et sort par l'autre. Ici, le solvant est déplacé activement par une pompe. La principale différence est que les molécules vont se déplacer différement dans la colonne et prednre un certains retard dans la migration. Elles vont donc se présenter avec un certains retard en sortie de colonne. Un detecteur placée en sortiede colonne va perdre de déceler le passage de chacune des substance. Ce detecteur va ici se baser sur les proriété physique de la molécule pour la detecter, comme par exemple une baisse de la resistivité si elle est chargée ou sa fluorescence aux ultraviolet. Il ne sera donc pas capable de dire quelle est cette molécule, juste de dire qu'elle est là, mais comme dans le cas précédent, le retard est parfaitement calibré et permettra de l'identifier. L'intensité de la réponse du detecteur va aussi permettre, après calibration, de donner la concentration de la molécule. Enfin, celle ci restant diluée dans le solvant pourra être récupérée en fractionnant le flux de sortie.
Cette variante de la chromatographie est donc plus complexe mais plus performante. Elle est également extremement riche car en jouant sur le matériaux contenu dans la colonne on peut faire varier les conditions de séparation des constituants.
Dans cette variante, l'intérieur de la colonne est soumis
à une forte pression. Les différents constituants vont être
séparés de façon plus efficaces, ce qui permet de
travailler avec des colonnes plus petites. Alors qu'une colonne standard
fait entre 20cm et 1m de haut, une HPLC peut se contenter de 5cm pour la
même efficacité. Cela permet d'utiliser une quantité
moindre du milieu poreux ou de travailler avec moins de solvants et donc
moins de substance. Toutes les variantes de colonnes précédentes
peuvent être appliquées à l'HPLC.
Aujourd'hui, par une glissement de langage, l'acronyme HPLC a changé
de signification : High Performance Liquid Chromatography ou chromatographie liquide hautes performances.
Il s'agit d'une chromatographie en colonne, mais ici le fluide est un gaz. La substance à analyser est vaporisée. Le fluide gazeux va l'entrainer jusqu'à la colonne qui va retarder les différents constituants du gaz. En sortie de colonne ces constituants vont pouvoir être detectés par plusieurs techniques, spectrometrie de masse, spectrometrie, ionisation, etc... Son principal interêt est qu'elle peut detecter des substances à l'état de traces. Etant surtout utilisée en minéralogie, moins en biologie, elle ne sera pas plus détaillée.
