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L'électrophorèse | ||
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L'électrophorèse permet, comme les deux techniques précédentes, une séparation des molécules en se basant sur une de leur propriété physique : ici leur charge électrique. Le principe consiste à mettre la solution contenant les molécules à séparer sur un gel acqueux entre une anode et une cathode et à faire passer un courant. Les ions positifs vont alors se déplacer vers la cathode et les ions négatifs vers l'anode, les molécules neutres ne bougeant pas. Cette technique est à la fois très puissante, car elle permet une séparation très fines des différentes et très (relativement) à facile à mettre en oeuvre. De plus; cette méthode est, comme la chromatographie, quantitative. Enfin, de par son mode opératoire, elle permet de traiter simultanément plusieurs échantillons sur un même gène et donc de soumettre ces échantillons exactement aux mêmes conditions expérimentales, pour des comparaisons fiables. Grace à ces qualités, elle est couramment utilisée dans les laboratoires de recherche, mais aussi d'analyses médicales pour doser les protéines sanguines.
Le milieu de migration est constitué généralement d'un gel acqueux coulé entre deux plaque de verre maintenues en position verticale. La base et le sommet du gel baignent dans un liquide conducteur, l'anode est située en bas du gel, la cathode en haut. Le sommet du gel est percé de plusieurs petits puits qui vont contenir les échantillons à séparer, les échantillons migrant verticalement par rapport à leur puit, les molécules ne vont pas se mélanger. A l'échantillon, est ajouté une molécule colorée dont les propriétés sont choisie pour être celle qui migrera le plus rappidement dans le mélange, ceci afin de surveiller la migration des autres molécules qui sont en général invisibles à ce stade. Quand la migration est achevée, le gel est seché pour éviter qu'il ne se délite puis révélé pour rendre visible l'ensemble des molécules. Chaque molécule apparait comme une bande fine, perpendiculaire au trajet de migration et dont l'intensité et l'épaisseur dépendent de sa concentration.
L'une des variantes les plus répandue de l'éléctrophorèse est la SDS-PAGE, utilisée pour séparer les protéines en fonction de leur poid moléculaire. Les protéines sont dénaturées par du S-dodecyl sulfate, molécule très fortement chargée négativement. Les charges négatives du SDS noient complétement les charges propres de la protéines qui n'interviennent alors plus. La charge de l'ensemble molécule dénaturée/SDS (et donc sa vitesse de migration) dépend alors uniquement de la longueur de la chaine protéique. S'il n'y avait pas le gel, toutes les protéines ainsi traitées migreraient à la même vitesse. Mais la présence du gel ralentit les grosses protéines, elles se répartiront le long du trajet de migration en fonction de leur poids moléculaire. C'est cette technique qui est mise en oeuvre dans les automates d'analyse médicale.
Une autre variante consiste à imposer un pH précis au gel de migration. Les molécules dont le pKa est égal au pH, neutres, ne migreront pas, les molécules avec un pKa inférieur, chargé négativement migreront vers l'anode, les autres vers la cathode. Une telle technique présente l'inconvénient d'obliger de déposer l'échantillon au milieu du gel, ce qui pose divers problème. Toutefois, un perfectionnement consiste à utiliser un gel dont le pH varie d'une extrémité à l'autre. La molécule migrera alors le long du gel jusqu'à ce que le pH local soit égal à son pKa. Elle deviendra alors neutre et arrêtera de migrer. Les protéines se répartiront alors le long du gel en fonction de leur pKa. Il est ici possible d'utiliser un gel vertical comme décrits dans le principe.
Le gel est un milieu solide qui peut être manipulé. Il est alors possible d'appliquer dessus successivement plusieurs techniques d'électrophorèse pour obtenir des électrophorèses bidimensionnelles. L'échantillon est déposé dans un seul puit et une première variante est appliquée. Puis la migration achevée on bascule le gel d'un quart de tour et on effectue une migration perpendiculaire à la première en utilisant une deuxième technique. Les molécules, séparées selon deux critères, se répartissent donc dans un système a deux coordonnées ce qui permet une meilleure résolution : si beaucoup de molécules ont un poids moléculaire ou un pKa proche, les molécules ayant les deux paramêtres en commun sont rares. Avec cette variante, il est possible de travailler sur des extraits cellulaires complets.
